?促炎性自身DNA的另一个来源是线粒体基因组（mtDNA）暴露于细胞质。线粒体DNA的释放已经被详细描述为发生凋亡的细胞，在那里它触发I型炎症。众所周知RT诱导细胞凋亡，因此，促炎症线粒体DNA释放的肿瘤细胞很可能在启动抗肿瘤免疫期间发挥重要作用。对小鼠的几项研究表明，cGAS对自身DNA和免疫激活的感知是通过摄取肿瘤线粒体DNA激活cpDC介导的。此外，随着mtDNA释放到肿瘤细胞的细胞质中，腹股沟肿瘤消退增加。总之，mtDNA可能是免疫原性DNA的另一个来源，在远隔效应开始时，在细胞质中被检测到。
?RT诱导的DNA损伤导致复制叉停滞和复制叉塌陷。完整的DNA修复途径能够抵消这种作用，这种途径的损伤可能导致受损的基因组DNA向细胞质中的促炎症释放。该模型的证据目前仅限于对肿瘤细胞系的研究。例如，缺失DNA修复蛋白SAMHD1的HEK293T细胞中过度的复制叉停滞导致大量的胞质单链DNA，从而诱导I型免疫信号。有人提出，在关键DNA修复因子RAD51和RPA被破坏后，核单链DNA的保留缺陷导致这些分子免疫刺激释放到细胞质中，但是DNA从细胞核运输到细胞质的机制尚未解释。类似地，HEK293T细胞另一研究显示，RT诱导细胞溶质单链DNA和双链DNA依赖于受损的复制叉进展和RAD51依赖的forkrescue。然而，鉴于cGAS不被ssDNA激活，参与检测细胞质受损自身ssDNA的PRR的身份仍有待确定。此外，由于DNA修复受损，复制应力相关DNA断裂和折叠叉受损单链DNA泄漏的相关性仍有待研究。事实上，在BRCA1突变细胞中，PARP抑制剂诱导的STAT1磷酸化仍然需要通过有丝分裂，这与RT刺激的免疫反应具有共性。然而，在RT中，复制叉经常停止和崩溃，这些炎症分子的最终细胞质目的地很可能在RT的远隔效应的开始中发挥作用。
?最后，鉴于细胞质自身DNA的促炎症性质，这些分子的负调节因子被认为是远隔效应的看门人。例如，细胞质核酸酶TREX1已被证明可降解细胞质DNA并抑制DNA损伤时的先天免疫诱导。事实上，TREX1的过度表达损害了小鼠的cpDC激活和抗肿瘤CTL启动，最终消除了RT/ICI的远隔效应。类似地，DNA损伤损伤后线粒体产生的细胞质DNA通过自噬被清除。肿瘤细胞自噬的基因敲除导致小鼠的远隔反应显著增加，这表明自噬通过去除促炎性自身DNA起到另一种负调节作用。因此，细胞质DNA的负调节因子也限制了远隔效应。综上所述，微核、线粒体或基因组复制应激导致细胞质DNA积累的DNA损伤可能是腹股沟肿瘤缓解期间先天免疫反应的激活剂。
Fig2.DNA损伤时感知自身核苷酸会触发先天免疫
细胞质DNA可能在核DNA损伤时产生，复制中间产物在修复过程中被切割并释放到细胞质中。细胞质DNA的其他来源包括线粒体DNA（mtDNA）和微核DNA的释放。这些分子已被证明被cGAS识别，cGAS通过激活和磷酸化ER相关的STING促进cGAMP的产生和随后的下游信号传导。这触发了一个涉及许多因素的磷酸化级联反应，包括TBK1和各种IKK家族蛋白。DNA损伤导致RNA释放到细胞质中，这是转录调控解除的结果，尤其是包括SINE在内的重复元件，以及mtRNA的释放。这些分子由RIG-I和MDA5感应，并通过与线粒体膜相关的MAV结合触发免疫信号。激活后，MAV被TRIM25等因子多泛素化，并参与类似于激活的STING的磷酸化级联反应。最终，这两者都导致IRF3和NF-κB的磷酸化和核移位，从而诱导先天性免疫效应基因的转录。
6.DNA损伤后产生的新抗原是远隔效应所必须的
?抗肿瘤免疫反应针对癌细胞中重排和过度表达的蛋白质，在此定义为肿瘤新抗原。鉴于远隔效应构成了这种反应，新抗原的产生可能是其发生的关键一步。放疗或化疗后的DNA损伤可能在这一过程中起关键作用。广泛或错误的DNA损伤会导致基因组不稳定，导致重新排列的多肽序列的翻译。此外，基因间不稳定性的增加可能导致转录物的过度表达，事实上，异常丰富的蛋白质是肿瘤新抗原的已知来源。
?DNA修复通过两条主要途径进行。在细胞周期的G2/M期，互补姐妹染色单体用于准确复制序列信息和修复无错误同源重组（H
R）中的断裂。另一方面，在G1期缺乏同源模板序列的情况下，DNA断裂主要通过非同源末端连接（NHEJ）进行修复。然而，细胞中存在许多其他的DDR途径，如选择性末端连接（Alt-EJ）；当HR和NHEJ被淹没或失活时，可使用这些功能。关键的是，这种替代性DDR途径通常具有内在致突变性，这被认为是基因序列变化的一个来源。事实上，新抗原经常由于肽序列的改变而出现，典型DDR途径的失活突变与肿瘤新抗原的增加相关。我们认为，DNA损伤会产生新抗原，当免疫细胞在克隆选择的人群中复发时，这些新抗原会成为免疫细胞的攻击点，从而出现远隔效应。
?特异性抗癌免疫反应性由识别肿瘤新抗原的CTL上的T细胞受体介导。为了开发肿瘤疫苗，已经对新抗原的特性进行了详细的研究，并且新抗原可能通过多种途径产生，所有这些途径都依赖于DNA损伤驱动的核苷酸序列变化（图3）。一类新抗原是由损伤诱导的重排驱动的，导致异常的启动子易位和蛋白质的非典型高表达。这是由DSB和异常的、Polθ介导的AltEJ在易位位点发生的。例如，在50%以上的前列腺癌中，转录因子ETS通过与TMPRSS2启动子序列融合而在高水平上异常表达。在前列腺癌的早期阶段，肿瘤细胞裂解后，抗肿瘤CTL针对ETS新抗原启动，随后在大多数疾病的发展过程中，ETS的直接作用和Treg的募集抑制了新抗原。类似地，转移性黑色素瘤通过易位非典型地表达高水平的昼夜节律基因BMAL1，这再次与肿瘤中大部分耗尽的CTL浸润相关。类似地，基因间DSB和随后的修复产生了融合癌基因，如BCR-ABL或-RUNX1，它们是在多种癌症中发现的有文献证明的驱动因素和新抗原。鉴于RT过程中大量的DNA损伤可能促进Alt-EJ的修复，我们提出类似于上述例子的染色体重排可能远隔外肿瘤缓解期间产生免疫靶新抗原。
?新抗原的另一个常见来源是导致肽序列改变的基因突变。这包括导致肿瘤特异性氨基酸变化的错义突变。与这种序列变化相对应的肽在癌症中被识别，并且已经记录了针对这种突变蛋白质的CTL介导的抗肿瘤免疫反应。错义突变与远隔抗肿瘤免疫反应有关。例如，过继转移b-Raf中一个点突变的特异性CTL导致远隔效应削弱。在其他情况下，突变蛋白也过度表达，可能有助于增强其免疫原性。
?错义突变不是导致新抗原肽的唯一遗传变化。例如，错配修复（MMR）缺陷与对ICI的强烈反应密切相关，并且PD-1拮抗剂被批准用于微卫星不稳定的癌症，而与来源组织无关。这是对癌症治疗的首次“肿瘤不可知论”认同，在这类患者中，移码突变可以预测反应，表明这种形式的基因组不稳定性在产生新抗原方面特别活跃。有趣的是，最近的研究表明，在MMR缺乏的情况下，以关键MMR蛋白MHL1的缺失为模型的抗肿瘤免疫可能涉及DSB的过度末端切除和异常DNA修复中间产物，这些中间产物会错分为微核，并通过如上所述的CGA/STING进行检测。然而，考虑到其他MMR因素，包括MHS2和MHS6，也可以预测患者ICI治疗后的抗肿瘤免疫反应，高突变负荷仍然是这种现象的主要促成因素更为合理。对各种癌症类型的系统分析表明，小的INDEL也会产生很大比例的新抗原。事实上，MMR缺陷癌症的移码突变与新抗原的产生有关。无论如何，在RT诱导的远隔效应缓解期间，这些序列变化的根本原因是DNA损伤。NHEJ和AltEJ的维修经常产生小的INDEL。
?因此，通过修复大量RT诱导的损伤而产生的改变的肽序列是远隔发生期间新抗原的另一个来源。这种免疫原性表位很可能补充通过替代方法产生的新抗原，这些新抗原在很大程度上独立于受损的DNA及其随后的修复。这包括由于选择性剪接而改变的肽序列，我们引导感兴趣的读者阅读最近关于这个主题的详尽综述。
Fig3.DNA损伤产生新抗原的机制。
受损的DNA可能是基因间的，也可能是基因和启动子序列之间的。在药物损伤或HR缺乏时，受损的DNA可通过末端连接途径修复（左侧）。由于AltEJ和MMR导致修复部位的小indels，因此这种修复与序列变化有关。除此之外，NHEJ的修复涉及到诸如Artemis等因素的末端处理，这也导致交界部位的小片段变化。总之，这种修复机制导致修复部位的核苷酸序列发生变化。由此产生的错义突变
能够引起氨基酸序列的变化，从而产生新抗原。在互补或替代机制中，两个不同位点的DNA断裂可能导致启动子易位和特定抗原的异常过度表达（右侧）。这些途径可能不是排他性事件，并可能在远隔效应期间产生免疫系统靶向的肿瘤新抗原。
亮点：
1.本文综述了感知自身核苷酸是导致远隔效应的免疫反应的初始触发因素；
2.由细胞质自身核苷酸引发的I型炎症改变了肿瘤微环境，从而允许新抗原的呈现；
3.天然免疫PRR靶向激动剂及其下游分子的出现，提出相关药物在治疗多种恶性肿瘤的临床前表现出很大的前景。
疑问：
1.新抗原的起源并未完全明确；
2.预测远隔效应是否存在分子标志物未能探讨；
启发：
1.肿瘤的新抗原应该如何研究？
2.放疗 免疫导致的不良反应增加是否也与自身核苷酸有关？
根据目前免疫标记物的检测策略，对ICIs的反应仍然是异质性的。一些晚期非小细胞肺癌患者在最初诊断时未发现转移，最终在手术后疾病进展过程中发生转移。
异时性转移患者通常表现为多发性远处转移，大多数患者在开始ICIs治疗前已接受系统治疗，如酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）、化疗或放疗（RT）。
新的研究表明，在接受新辅助治疗的NSCLC患者中，治疗方案可能会影响PD-L1的表达和肿瘤免疫环境的特征。
PD-L1表达和免疫细胞浸润的肿瘤异质性、多样性一直是免疫治疗领域关注的问题。肿瘤转移过程中可能发生肿瘤免疫微环境（TIME）的动态演变。在一定比例的转移性肿瘤（MTs）和相应的原发性肿瘤（PTs）之间， PD-L1表达存在差异。
评估MTS与相应PTS的肿瘤免疫背景可能揭示NSCLC转移过程中免疫标记物的变化。一个主要的挑战是，此类研究受到实际临床过程的限制，在实际临床过程中，活检样本可能无法显示令人满意的免疫微环境全景图，这可能导致活检和手术标本之间肿瘤内异质性的偏差。
在这项研究中，我们收集了成对的手术切除的原发性和转移性样本，以避免活检中潜在的异质性。我们利用多重免疫荧光（MF）和数字图像分析定量鉴定NSCLC中PD-L1的表达和肿瘤浸润性淋巴细胞（TLL）。
28例样本，8例有两处转移，共64个样本。14例肺内转移，22例肺外转移
NSCLC原发和转移部位中PD-L1表达和TIL的异质性
原发性和转移性NSCLC肿瘤中每个细胞亚群的mIF染色的代表性图像如图1A所示。结果表明，MTs通常在PD-L1 细胞群中具有较高的PD-L1表达水平（p=0.042）和较高的TPS（中位数：29.16%vs18.50%；平均值：42.34%vs35.91%，p=0.096）。MTs中较低密度的CD8 CTL（p=0.022）具有显著性差异，但未发现ICs到TCs的空间距离存在统计学差异。使用符号秩检验确定配对PTs和MTs之间定量免疫标记物的异质性。
?RT诱导的DNA损伤导致复制叉停滞和复制叉塌陷。完整的DNA修复途径能够抵消这种作用，这种途径的损伤可能导致受损的基因组DNA向细胞质中的促炎症释放。该模型的证据目前仅限于对肿瘤细胞系的研究。例如，缺失DNA修复蛋白SAMHD1的HEK293T细胞中过度的复制叉停滞导致大量的胞质单链DNA，从而诱导I型免疫信号。有人提出，在关键DNA修复因子RAD51和RPA被破坏后，核单链DNA的保留缺陷导致这些分子免疫刺激释放到细胞质中，但是DNA从细胞核运输到细胞质的机制尚未解释。类似地，HEK293T细胞另一研究显示，RT诱导细胞溶质单链DNA和双链DNA依赖于受损的复制叉进展和RAD51依赖的forkrescue。然而，鉴于cGAS不被ssDNA激活，参与检测细胞质受损自身ssDNA的PRR的身份仍有待确定。此外，由于DNA修复受损，复制应力相关DNA断裂和折叠叉受损单链DNA泄漏的相关性仍有待研究。事实上，在BRCA1突变细胞中，PARP抑制剂诱导的STAT1磷酸化仍然需要通过有丝分裂，这与RT刺激的免疫反应具有共性。然而，在RT中，复制叉经常停止和崩溃，这些炎症分子的最终细胞质目的地很可能在RT的远隔效应的开始中发挥作用。
?最后，鉴于细胞质自身DNA的促炎症性质，这些分子的负调节因子被认为是远隔效应的看门人。例如，细胞质核酸酶TREX1已被证明可降解细胞质DNA并抑制DNA损伤时的先天免疫诱导。事实上，TREX1的过度表达损害了小鼠的cpDC激活和抗肿瘤CTL启动，最终消除了RT/ICI的远隔效应。类似地，DNA损伤损伤后线粒体产生的细胞质DNA通过自噬被清除。肿瘤细胞自噬的基因敲除导致小鼠的远隔反应显著增加，这表明自噬通过去除促炎性自身DNA起到另一种负调节作用。因此，细胞质DNA的负调节因子也限制了远隔效应。综上所述，微核、线粒体或基因组复制应激导致细胞质DNA积累的DNA损伤可能是腹股沟肿瘤缓解期间先天免疫反应的激活剂。
Fig2.DNA损伤时感知自身核苷酸会触发先天免疫
细胞质DNA可能在核DNA损伤时产生，复制中间产物在修复过程中被切割并释放到细胞质中。细胞质DNA的其他来源包括线粒体DNA（mtDNA）和微核DNA的释放。这些分子已被证明被cGAS识别，cGAS通过激活和磷酸化ER相关的STING促进cGAMP的产生和随后的下游信号传导。这触发了一个涉及许多因素的磷酸化级联反应，包括TBK1和各种IKK家族蛋白。DNA损伤导致RNA释放到细胞质中，这是转录调控解除的结果，尤其是包括SINE在内的重复元件，以及mtRNA的释放。这些分子由RIG-I和MDA5感应，并通过与线粒体膜相关的MAV结合触发免疫信号。激活后，MAV被TRIM25等因子多泛素化，并参与类似于激活的STING的磷酸化级联反应。最终，这两者都导致IRF3和NF-κB的磷酸化和核移位，从而诱导先天性免疫效应基因的转录。
6.DNA损伤后产生的新抗原是远隔效应所必须的
?抗肿瘤免疫反应针对癌细胞中重排和过度表达的蛋白质，在此定义为肿瘤新抗原。鉴于远隔效应构成了这种反应，新抗原的产生可能是其发生的关键一步。放疗或化疗后的DNA损伤可能在这一过程中起关键作用。广泛或错误的DNA损伤会导致基因组不稳定，导致重新排列的多肽序列的翻译。此外，基因间不稳定性的增加可能导致转录物的过度表达，事实上，异常丰富的蛋白质是肿瘤新抗原的已知来源。
?DNA修复通过两条主要途径进行。在细胞周期的G2/M期，互补姐妹染色单体用于准确复制序列信息和修复无错误同源重组（H
R）中的断裂。另一方面，在G1期缺乏同源模板序列的情况下，DNA断裂主要通过非同源末端连接（NHEJ）进行修复。然而，细胞中存在许多其他的DDR途径，如选择性末端连接（Alt-EJ）；当HR和NHEJ被淹没或失活时，可使用这些功能。关键的是，这种替代性DDR途径通常具有内在致突变性，这被认为是基因序列变化的一个来源。事实上，新抗原经常由于肽序列的改变而出现，典型DDR途径的失活突变与肿瘤新抗原的增加相关。我们认为，DNA损伤会产生新抗原，当免疫细胞在克隆选择的人群中复发时，这些新抗原会成为免疫细胞的攻击点，从而出现远隔效应。
?特异性抗癌免疫反应性由识别肿瘤新抗原的CTL上的T细胞受体介导。为了开发肿瘤疫苗，已经对新抗原的特性进行了详细的研究，并且新抗原可能通过多种途径产生，所有这些途径都依赖于DNA损伤驱动的核苷酸序列变化（图3）。一类新抗原是由损伤诱导的重排驱动的，导致异常的启动子易位和蛋白质的非典型高表达。这是由DSB和异常的、Polθ介导的AltEJ在易位位点发生的。例如，在50%以上的前列腺癌中，转录因子ETS通过与TMPRSS2启动子序列融合而在高水平上异常表达。在前列腺癌的早期阶段，肿瘤细胞裂解后，抗肿瘤CTL针对ETS新抗原启动，随后在大多数疾病的发展过程中，ETS的直接作用和Treg的募集抑制了新抗原。类似地，转移性黑色素瘤通过易位非典型地表达高水平的昼夜节律基因BMAL1，这再次与肿瘤中大部分耗尽的CTL浸润相关。类似地，基因间DSB和随后的修复产生了融合癌基因，如BCR-ABL或-RUNX1，它们是在多种癌症中发现的有文献证明的驱动因素和新抗原。鉴于RT过程中大量的DNA损伤可能促进Alt-EJ的修复，我们提出类似于上述例子的染色体重排可能远隔外肿瘤缓解期间产生免疫靶新抗原。
?新抗原的另一个常见来源是导致肽序列改变的基因突变。这包括导致肿瘤特异性氨基酸变化的错义突变。与这种序列变化相对应的肽在癌症中被识别，并且已经记录了针对这种突变蛋白质的CTL介导的抗肿瘤免疫反应。错义突变与远隔抗肿瘤免疫反应有关。例如，过继转移b-Raf中一个点突变的特异性CTL导致远隔效应削弱。在其他情况下，突变蛋白也过度表达，可能有助于增强其免疫原性。
?错义突变不是导致新抗原肽的唯一遗传变化。例如，错配修复（MMR）缺陷与对ICI的强烈反应密切相关，并且PD-1拮抗剂被批准用于微卫星不稳定的癌症，而与来源组织无关。这是对癌症治疗的首次“肿瘤不可知论”认同，在这类患者中，移码突变可以预测反应，表明这种形式的基因组不稳定性在产生新抗原方面特别活跃。有趣的是，最近的研究表明，在MMR缺乏的情况下，以关键MMR蛋白MHL1的缺失为模型的抗肿瘤免疫可能涉及DSB的过度末端切除和异常DNA修复中间产物，这些中间产物会错分为微核，并通过如上所述的CGA/STING进行检测。然而，考虑到其他MMR因素，包括MHS2和MHS6，也可以预测患者ICI治疗后的抗肿瘤免疫反应，高突变负荷仍然是这种现象的主要促成因素更为合理。对各种癌症类型的系统分析表明，小的INDEL也会产生很大比例的新抗原。事实上，MMR缺陷癌症的移码突变与新抗原的产生有关。无论如何，在RT诱导的远隔效应缓解期间，这些序列变化的根本原因是DNA损伤。NHEJ和AltEJ的维修经常产生小的INDEL。
?因此，通过修复大量RT诱导的损伤而产生的改变的肽序列是远隔发生期间新抗原的另一个来源。这种免疫原性表位很可能补充通过替代方法产生的新抗原，这些新抗原在很大程度上独立于受损的DNA及其随后的修复。这包括由于选择性剪接而改变的肽序列，我们引导感兴趣的读者阅读最近关于这个主题的详尽综述。
Fig3.DNA损伤产生新抗原的机制。
受损的DNA可能是基因间的，也可能是基因和启动子序列之间的。在药物损伤或HR缺乏时，受损的DNA可通过末端连接途径修复（左侧）。由于AltEJ和MMR导致修复部位的小indels，因此这种修复与序列变化有关。除此之外，NHEJ的修复涉及到诸如Artemis等因素的末端处理，这也导致交界部位的小片段变化。总之，这种修复机制导致修复部位的核苷酸序列发生变化。由此产生的错义突变
能够引起氨基酸序列的变化，从而产生新抗原。在互补或替代机制中，两个不同位点的DNA断裂可能导致启动子易位和特定抗原的异常过度表达（右侧）。这些途径可能不是排他性事件，并可能在远隔效应期间产生免疫系统靶向的肿瘤新抗原。
亮点：
1.本文综述了感知自身核苷酸是导致远隔效应的免疫反应的初始触发因素；
2.由细胞质自身核苷酸引发的I型炎症改变了肿瘤微环境，从而允许新抗原的呈现；
3.天然免疫PRR靶向激动剂及其下游分子的出现，提出相关药物在治疗多种恶性肿瘤的临床前表现出很大的前景。
疑问：
1.新抗原的起源并未完全明确；
2.预测远隔效应是否存在分子标志物未能探讨；
启发：
1.肿瘤的新抗原应该如何研究？
2.放疗 免疫导致的不良反应增加是否也与自身核苷酸有关？
根据目前免疫标记物的检测策略，对ICIs的反应仍然是异质性的。一些晚期非小细胞肺癌患者在最初诊断时未发现转移，最终在手术后疾病进展过程中发生转移。
异时性转移患者通常表现为多发性远处转移，大多数患者在开始ICIs治疗前已接受系统治疗，如酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）、化疗或放疗（RT）。
新的研究表明，在接受新辅助治疗的NSCLC患者中，治疗方案可能会影响PD-L1的表达和肿瘤免疫环境的特征。
PD-L1表达和免疫细胞浸润的肿瘤异质性、多样性一直是免疫治疗领域关注的问题。肿瘤转移过程中可能发生肿瘤免疫微环境（TIME）的动态演变。在一定比例的转移性肿瘤（MTs）和相应的原发性肿瘤（PTs）之间， PD-L1表达存在差异。
评估MTS与相应PTS的肿瘤免疫背景可能揭示NSCLC转移过程中免疫标记物的变化。一个主要的挑战是，此类研究受到实际临床过程的限制，在实际临床过程中，活检样本可能无法显示令人满意的免疫微环境全景图，这可能导致活检和手术标本之间肿瘤内异质性的偏差。
在这项研究中，我们收集了成对的手术切除的原发性和转移性样本，以避免活检中潜在的异质性。我们利用多重免疫荧光（MF）和数字图像分析定量鉴定NSCLC中PD-L1的表达和肿瘤浸润性淋巴细胞（TLL）。
28例样本，8例有两处转移，共64个样本。14例肺内转移，22例肺外转移
NSCLC原发和转移部位中PD-L1表达和TIL的异质性
原发性和转移性NSCLC肿瘤中每个细胞亚群的mIF染色的代表性图像如图1A所示。结果表明，MTs通常在PD-L1 细胞群中具有较高的PD-L1表达水平（p=0.042）和较高的TPS（中位数：29.16%vs18.50%；平均值：42.34%vs35.91%，p=0.096）。MTs中较低密度的CD8 CTL（p=0.022）具有显著性差异，但未发现ICs到TCs的空间距离存在统计学差异。使用符号秩检验确定配对PTs和MTs之间定量免疫标记物的异质性。